限制酶作用位点(限制酶连接酶等的作用及位点)

1. 限制酶连接酶等的作用及位点

限制性内切酶：可以切割磷酸二酯键DNA连接酶：可以连接被限制酶切割开磷酸二酯键DNA聚合酶：使DNA两链中的H键结合解旋酶：使DNA两链中的H键断开参考资料：生物教材~~

2. 限制酶和连接酶的区别

基因工程中主要的工具酶有限制酶和dna连接酶。限制酶的作用是切割目的基因两端，而dna连接酶是将目的基因和运输体的黏性末端连接在一起。

基因工程工具酶主要包括限制酶、聚合酶、连接酶、修饰酶和核酸酶五大类，具体解释如下：

1、DNA限制性内切酶生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。它是可以将外来的DNA切断的酶，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息；

2、连接酶它是一种封闭DNA链上缺口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5'-PO4与另一DNA链的3'-OH生成磷酸二酯键；

3、聚合酶系专司生物催化合成脱氧核糖核酸和核糖核酸的一类酶的统称；

4、核酸酶核酸酶有DNase、RNase、核酸酶S1等，可水解相应的DNA和RNA，核酸酶S1可降解单链DNA和RNA，用量增大也可降解双链核酸，它可用于切去ds-cDNA合成中产生的发夹环；

5、修饰酶体内有些酶可在其他酶的作用下，将酶的结构进行共价修饰，使该酶活性发生改变，这种调节称为共价修饰调节。

3. 限制酶的识别位点

质粒的多克隆位点上有很多限制酶的酶切位点，就是有多个限制性内切酶的切割位点，是为了重组基因时插入目的基因的，可以采用双酶切的方法酶切质粒和目的片段，产生粘性末端，再使酶切后的质粒和目的基因进行连接，就可以获得了插入了目的基因的质粒，可以进一步进行转化实验。

4. 限制酶的酶切位点

1.限制性核酸内切酶是具有特异性的蛋白质，只要有该内切酶特定识别的DNA序列出现它就会起作用，跟几率无关内切酶本身的蛋白质决定识别的序列，也就是识别的长短也是有蛋白质决定的，其他的因素只能影响内切酶的活性

2.识别的序列越长，在DNA中出现的几率越低。如识别四碱基的酶的酶切位点出现的概率为4^4=256bp,而六碱基的出现的概率为4^6.不考虑碱基偏爱性，认为四种碱基在基因组上平均分布得出的概率，各种DNA概率会有偏差，但是总体上4碱基的酶切位点出现的概率肯定较6碱基的大。

5. 限制酶的作用位点在哪里

如果要获得互补的缺口用于连接，而载体或目标片段上又有多个酶切位点，如果有同尾酶的话就可以使用。一般情况下切割载体和目的基因需要使用相同的酶，偶尔也会使用不同的同尾酶。

6. 限制酶作用的对象和作用的具体部位

DNA聚合酶和DNA连接酶都是形成磷酸二酯键，但两者不同之处是：DNA聚合酶催化单个脱氧核酸聚合，且需要有模板；而DNA连接酶是将两个DNA片段之间连接。

RNA聚合酶，催化转录形成RNA的酶，将单个核糖核苷酸聚合，也是形成磷酸二酯键。

限制酶是断裂磷酸二酯键。

解旋酶是使氢键断裂。

7. 限制酶与连接酶的区别

基因工程涉及众多的工具酶可粗略的分为限制酶，连接酶，聚合酶和修饰酶四大类。其中，以限制性核酸内切酶和DNA连接酶在分子克隆中的作用最为突出。

8. 各种酶的作用位点

别构酶结构　　别构酶多为寡聚酶，含有两个或多个亚基。其分子中包括两个中心：一个是与底物结合、催化底物反应的活性中心；另一个是与调节物结合、调节反应速度的别构中心。两个中心可能位于同一亚基上，也可能位于不同亚基上。在后一种情况中，存在别构中心的亚基称为调节亚基。别构酶是通过酶分子本身构象变化来改变酶的活性。　　调节物也称效应物或调节因子。一般是酶作用的底物、底物类似物或代谢的终产物。调节物与别构中心结合后，诱导或稳定住酶分子的某种构象，使酶的活性中心对底物的结合与催化作用受到影响，从而调节酶的反应速度和代谢过程，此效应称为酶的别构效应（allosteric effect ）。因别构导致酶活力升高的物质，称为正效应物或别构激活剂，反之为负效应物或别构抑制剂。不同别构酶其调节物分子也不相同。有的别构酶其调节物分子就是底物分子，酶分子上有两个以上与底物结合中心，其调节作用取决于分子中有多少个底物结合中心被占据。别构酶的反应初速度与底物浓度（V对［S］）的关系不服从米氏方程。而是呈现S形曲线。S形曲线表明，酶分子上一个功能位点的活性影响另一个功能位点的活性，显示协同效应（cooperative effect ）, 当底物或效应物一旦与酶结合后，导致酶分子构象的改变，这种改变了的构象大大提高了酶对后续的底物分子的亲和力。结果底物浓度发生的微小变化，能导致酶促反应速度极大的改变。　　天冬氨酸转氨甲酰酶（Aspartate transcarbamoylase ATCase）是了解最清楚的一个别构酶。它催化嘧啶核苷酸合成途径中的第一个中间物N – 氨甲酰天冬氨酸的合成，ATCase受其代谢途径的终产物CTP 的别构抑制。ATCase 由两个三聚体构成的催化亚基（C3）和三个二聚体构成的调节亚基（r2）组成。当催化亚基和调节亚基混合时能迅速结合。　　CTP 的抑制剂的影响、ATP的激活、以及协同结合底物均受四级结构的巨大变化所调节，通过催化亚基和调节亚基之间的相互作用产生别构效应。机理：(一) Hill模式: 把研究血红蛋白动力学应用到别构动力学。 E + nS k1 ESn k2 E + P k -1 总的解离常数Ks’= [E][S]n [E0]=[E] + [ESn] [ESn] 饱和分数： Ys = 酶所结合的底物分子数酶上底物结合位点数 Ys= n [ESn] = [S]n n [E0] Ks′+ [S]nHill方程 : Log( Ys ) =nLog[S] - LogKs′ ① 1 - Ys Log( Ys ) ~ Log[S] 作图 1-Ys V=k2 [ESn] Vm=k2 [E0] V/Vm = [ESn] / [E0] = Ys带入①中得: Log( V ) = nLog[S] – LogKs’ ② Vm - V 作图直线的斜率为n（Hill系数）(二) MWC模式： Monod-Wyman-Changeux :于1965年提出，也称齐变模式1. 模式要点: ① 别构蛋白是一种寡聚体，由多个相同原体构成。原体是寡聚蛋白最小的功能单位，它们在别构蛋白中占有相等的地理位置。寡聚蛋白至少有一个对称轴。② 每个亚基对同一种配体只有一个结合位点。③ 蛋白亚基可具有R型和T型两种构象。这两种构象在无底物和效应剂存在时处于平衡状态。④ 蛋白亚基都只能取相同的构象，无杂合体。亚基齐步转变⑤ 亚基的构象可变，但蛋白分子的对称性不变。⑥ 无论多少配体结合到酶上，配体与R态和T态酶的内在解离常数都相等，分别以KR和KT表示。(三) KNF模式Koshland-Nemethy-Filmer 于1966年提出1. 模式要点: ① 对聚合体酶来说，每个亚基可有R和T两种状态，但在无底物和效应剂存在时只有T态。 ②亚基的构象改变可由于且只能由于配基和底物的结合引起，构象的改变是序变过程，存在杂合体 ③ 酶构象的改变只影响相邻亚基的变化，使其他配基的亲和力增加或减小。激活剂与酶结合后，不影响酶继续结合底物；而抑制剂结合到酶分子上之后，使酶的构象发生改变，不再与底物结合——解释异种协同效应(四) EIG模式:也称为总模式（general scheme），是1967年由Eigen提出的。要点:① 酶无论是否结合配体，亚基的构象都能发生变化 ② 在同种酶分子中不同的构象的杂合体都能依次与底物结合